qPCR：质量控制与相对表达

初次验证发现两个需要修正的展示问题：运行环境缺少中文绘图字体，且内参稳定性不应借助会受处理影响的目标基因来判定。我会改为直接比较候选内参 Ct 的组间漂移与组内离散度，并将 PNG 标签改为英文，中文解释仍完整保留在 HTML。

已完成一套完全虚构的小型 qPCR 规范分析演示，并实际生成了数据、分析结果、质量控制表、图、中文 HTML 报告和可复现 Python 脚本。

交付物

项目目录中已保存：

qPCR_demo_output/

其中包含：

• qPCR_report.html：中文 HTML 分析报告
• raw_ct.csv：原始 Ct 数据，共 144 条记录
• technical_qc.csv：技术重复质量控制表
• sample_level_results.csv：样本级汇总结果
• sample_level_results_long.csv：长格式样本级结果
• reference_stability.csv：候选内参稳定性分析表
• relative_expression_summary.csv：ΔΔCt、fold change 和 95% CI
• technical_dispersion.png：技术重复离散度图
• reference_stability.png：候选内参稳定性图
• relative_expression.png：相对表达图
• qPCR_demo_analysis.py：可复现 Python 脚本

脚本运行方式：

python qPCR_demo_analysis.py --outdir qPCR_demo_output

实验设计

• 对照组：8 个生物学重复
• 处理组：8 个生物学重复
• 每个样本检测：
  • Target
  • RefA
  • RefB
• 每个样本、每个基因设置 3 个技术重复

本演示明确区分：

• 生物学重复：独立样本，统计分析中的 n，最终为每组 n=8
• 技术重复：同一样本的重复孔，仅用于检测孔内测定误差和进行样本级 Ct 汇总，不增加生物学样本量

技术重复 QC

预设质量标准：

• 技术重复 Ct 标准差 ≤ 0.30 Ct
• 且技术重复 Ct 极差 ≤ 0.80 Ct

判定结果：

• 共 48 个“样本 × 基因”技术重复组
• 47 个 PASS
• 1 个 FAIL
• 预置异常孔：Tr_03 / Target / tech-3
• 该异常技术孔按预设规则排除
• 排除后仍保留 Tr_03 这个生物学重复，因此最终统计仍为：

Control: n = 8 biological replicates
Treated: n = 8 biological replicates

内参稳定性

模拟结果：

因此最终使用 RefA 作为归一化内参。

需要注意：本数据是人为构造的，RefB 的处理组偏移是故意加入的不稳定情形。报告中也说明了：真实研究不应仅依赖两个候选内参，应增加候选内参数量，并结合 geNorm、NormFinder、扩增效率和实验背景进行验证。

ΔCt / ΔΔCt / fold change

最终使用 RefA：

ΔCt = Ct(Target) − Ct(RefA)

ΔΔCt = mean(ΔCt_Treated) − mean(ΔCt_Control)

fold change = 2^(-ΔΔCt)

生成的结果：

在这套虚构数据中，处理组相对于对照组的 Target 相对表达约为：

0.389 倍

即约为对照组的 38.9%。

不确定性分析

95% CI 的计算方法：

1. 先在每个生物学样本内汇总技术重复 Ct
2. 对每个样本计算 ΔCt
3. 使用两组生物学重复的 ΔCt 均值差计算 ΔΔCt
4. 使用独立两组 t 分布近似，df=14
5. 将 ΔΔCt 区间通过 2^(-x) 单调变换为 fold-change 区间

该区间主要反映：

• 生物学重复间变异
• 样本均值估计的不确定性

不包括：

• 移液误差的完整传播
• 逆转录效率误差
• 扩增效率偏离 100% 的影响
• 批次效应
• 引物特异性和熔解曲线判断的不确定性
• 内参选择本身的不确定性

如果实际扩增效率不是接近 100%，应改用效率校正的相对定量方法，而不是直接使用 2^-ΔΔCt。

已实际运行脚本并校验输出成功。